구강세포 DNA 추출하기(Full-Type)

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Ⅰ. 실험 목표

자신의 구강상피세포에서 DNA를 추출하여, 튜브에 저장하여 보관한다.

Ⅱ. 실험 재료

· 재료 :　Lysis buffer, Flash blue™ stain, Proteinase K(단백질분해효소), 에탄올, 생리식염수

· 기구 : DNA 분리를 위한 여분의 튜브, e-tube, 단계별로 사용할 일회용 스포이드, 유전자를 보관할 클리어 튜브, 일회용 컵, 항온 수조, 튜브랙, 원심분리기, 실험용 장갑

· 제품구성: 20mL Lysis buffer, 4mL Flash blue™ stain, 1mL Proteinase K, 60mL 에탄올, 20mL 생리식염수 Clear Tube 20개, 1mL Cryovial 20개, 일회용마이크로피펫 60개, 

                 일회용피펫 60개, MicroTube 40개, 투명컵 20개

Ⅲ. 실험 과정

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⑴ 컵에 생리식염수 1mL를 담고 본인의 이름을 기재한다.

⑵ 45초 동안 입을 강하게 헹궈준다.(이때, 더 많은 세포를 얻기 위해 뺨 안쪽을 살짝 씹어준다. - 피가 나지 않게 주의!)

⑶ 피펫을 이용하여 입을 헹군 식염수를 멸균처리 된 뚜껑이 있는 튜브로 옮긴다.

⑷ 식염수가 담긴 튜브에 1mL의 Lysis buffer를 넣는다.

⑸ 피펫을 이용하여 단백질 분해효소를 5방울 정도 넣고 튜브를 흔들어 잘 섞어준다.(Vortex Mixer 사용)

⑹ 잘 섞어 준 튜브를 56℃에서 10분 동안 배양해준다. (수조 또는 Mini Dry Bath 사용)

⑺ 배양된 튜브를 실온에 5분 정도 둔다.

⑻ 튜브를 45도 정도 각도로 잡고 피펫을 이용하여 튜브 측면에 차가운 에탄올(or isopropanol)을 1mL 흘려준다.

⑼ 튜브랙에 꽂아둔 뒤 실온에 5분 정도 둔다.

⑽ 튜브 안의 용액의 표면에서 DNA가 보이는지 확인한다. 일부 DNA는 짙은 회색으로 보이거나 거품이 생길 수도 있다.

⑾ 마이크로 피펫을 이용하여 소량의 DNA를 추출한 후 마이크로 튜브 목걸이에 넣는다.

⑿ 나머지 DNA가 들어 있는 튜브에 Flash blue™ solution 1방울 정도 넣어 DNA를 염색한다.

▶ 전기영동을 하려면 고속원심분리기를 이용하여 DNA을 수집한다.

▶ Flash blue™ stain은 추출된 DNA를 눈에 잘 띄게 하는 염색약이다. DNA는 알콜과 수성 경계에서 진한 파란색
실 같은 가닥으로 나타나는데, 이 염색약은 DNA보다 더 밝은 파란색으로 나타난다.

Ⅳ. 실험결과 및 토의

⑴ DNA모양을 묘사해보자.

⑵ 세포핵에는 무엇이 포함되어 있습니까?

⑶ 세포 용해는 무엇을 의미합니까?

⑷ 에탄올(or Isopropanol)이 DNA 용액 위에 층을 형성한 이유는 무엇입니까?

교사용 실험자료

Ⅰ. 실험 전 준비사항

⑴ 학생 수 대로 3mL의 에탄올을 마이크로 튜브에 넣고, 필요할 때까지 얼음 위에 놓는다.

⑵ 학생 수 대로 Cryo Vial에 1mL 씩 Lysis buffer를 넣는다.

(참고 : Lysis buffer와 알콜을 첨가한 후 생성된 용액이 튜브 용량에 맞지 않을 수 있으므로 1mL를 초과하지 않는다.)

※ 학생 당 필요한 실험재료

· 1mL Lysis buffer, clear Tube 1개, 일회용마이크로피펫 3개, 일회용피펫 3개, 1컵의 생리식염수(1mL)

· 50㎕ Proteanase K(조별 사용가능), 100㎕ Flash Blue™ Stain(조별 사용가능), 3mL 차가운 알콜

Ⅱ. 확장 실험

학생들이 실험에서 변수를 생각하여 결과를 변경하고 예측할 수 있도록 지도하십시오.

아래는 학생들이 시도 할 수 있는 선택적 활동의 몇 가지 예이다.

▶ Lysis buffer만으로 실험을 수행한다. (구강세포는 추가되지 않음)

단백질 분해효소를 첨가하고 알콜을 다량 첨가한다. 이 튜브와 DNA가 포함된 튜브의 차이를 기록해본다.

▶ DNA를 분리하고 보존 단계에서 단백질 분해효소 및 알콜을 제거한다. 이때 DNA 샘플은 어떻게 되는지 관찰한다.

▶ 알콜을 첨가한 후 스풀링으로 DNA를 분리한다. DNA는 밤새 증류수에 용해되어 회수되고 이는 전기영동을 위해 사용될 수 있다. (전기영동 재료는 포함되지 않음)

▶ DNA를 분리하고 DNA 샘플에서 PCR을 수행해볼 수 있다. (PCR 재료는 포함되지 않음)