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Lambda DNA 제한효소처리 실험

Ⅰ. 서론

박테리아는 외부에서 들어오는 DNA를 절단하여 자신을 보호하는 기능이 있는데, 이와 같이 DNA를 절단하는 효소를 제한효소(restriction enzyme)라 하며, DNA를 정해진(제한된) 장소에서 절단하기 때문에 이런 이름이 붙었다. 본래는 대장균에 감염한 람다 파지(λ-phage)의 DNA가 들어오면 그것을 절단하는 제한효소가 있는데, 이 효소는 외래 DNA의 특정한 염기서열을 인식하여 절단하여 자신을 보호한다. 제한효소는 이런 특성 때문에 유전자 클로닝과 유전자 지도 작성 등 분자생물학의 연구에 필수적으로 사용되고 있는 실험방법 가운데 하나이다.

Ⅱ. 실험목표

⑴ 제한 효소가 DNA에 어떻게 작용하는지 이해한다.

⑵ DNA를 절단하는 효소의 종류와 그 효소의 작용을 이해한다.

⑶ 제한 효소에 의해 절단된 DNA 조각들의 크기를 전기영동 방법으로 분석할 수 있다.

Ⅲ. 실험재료

37℃ 항온수조(or Mini-Incubator), E-튜브, 전기영동장치, 1% 아가로스 겔(TBE), 1X TBE Buffer, Dyne LoadingStar DNA stain, Instant λ DNA 1~2개, 증류수, Instant Enzyme HindⅢ, Instant Enzyme Eco RI, (Option: 1kb DNA Marker), 마이크로피펫, 팁, UV Transilluminator

Ⅳ. 탐구활동

⑴ 실험 과정(방법1)

① Instant λ DNA에 3차 증류수 100㎕ 넣고 약하게 흔들어서 DNA가 풀어지도록 한다.

② λ DNA용액을 각각 20㎕씩 Instant Enzyme HindⅢ Tube, Instant Enzyme EcoRI Tube에 넣는다.

③ 튜브를 37℃ 항온수조 또는 인큐베이터에 30분 정도 넣어둔다.

④ 튜브를 꺼내고,제한효소를 처리하지 않은 원본을 포함하여, 각 튜브에 4㎕ Dyne LoadingStar DNA stain Stain을 첨가한다. 튜브의 바닥에서 DNA 샘플과 염색용액을 확실히 섞는다. 염색시간 약 3분

⑤ 1% 아가로스 겔을 전기영동장치 탱크에 넣고 1X TBE Buffer를 겔이 잠길 정도로 붓는다.

⑥ 각 웰에 제한효소를 처리하지 않은 λ DNA와 제한효소를 처리한 λ DNA를 12㎕씩 주입한다. (1kb DNA Marker가 있다면 같이 주입한다.)

⑦ 전기영동 장치를 켜고 대략 30분 정도 기다린다. 염색용액이 아가로스 겔의 3/4정도까지 이동하면 전원을 끈다.

주위의 불을 끄고, UV Transillumintor로 겔을 비추어 흰색 밴드를 관찰한다. (가시광선에 보이는 염색라인이 아닙니다.)

⑵ 추가실험

- 제한효소 BamHI을 추가로 실험할 수 있다.

Ⅴ. 실험결과 및 토의

① HindⅢ에 의해 절단된 λ DNA 단편들의 크기는 다음과 같다. 각 단편들의 이동 거리를 홈의 앞면에서부터 띠의 끝까지 측정하여 기록하고, 이와 비교하여 Eco RⅠ으로 처리한 것도 기록한다.

단편	Hind Ⅲ		Eco RⅠ
단편	크기(kb)	이동거리(mm)	크기(kb)	이동거리(mm)
1	23.1
2	9.42
3	6.56
4	4.36
5	2.32
6	2.03
7	0.56

② 제한효소를 처리한 것과 처리하지 않은 것의 이동성에 어떤 차이점이 있는지 적고, 그 이유를 설명하라.

③ 만일 제한효소가 원형인 DNA를 한번 잘랐다면 몇 개의 단편이 생길까?

④ 실험결과를 보면, HindⅢ와 EcoR I은 각각 DNA를 몇 군데 잘랐는가?

⑤ 위의 탐구활동을 통해서 제한효소에 대해 알게 되었다. 그런데, 효소 중에는 리가아제라는 효소도 있다. 이 효소는 제한효소에 의해 절단된 부위를 다시 붙이는 것이다. 이 두가지 효소를 어떻게 이용할 수 있을지 자세히 적어보자.

Ⅵ. 참고자료

⑴ 많은 제한효소는 보통 10㎍의 DNA를 1㎕의 효소로 1시간 동안 처리할 수 있을 정도로 농축되어 판매된다. 효소 반응 시에 반응 부피는 가능한 물의 부피를 적게 하여 최소화한다. 효소 처리용 완충용액은 판매회사에서 효소와 함께 농축된 용액(10x)을 제공한다.

⑵ 제한효소는 종류에 따라 다른 제한부위를 보여 주고 있다. HaeⅢ과 같은 효소는 4개의 염기서열을 인식하여 비점착성 말단(blunt ends)를 생성하기도 하고, 반대로 BamH1과 같은 효소는 6개의 염기서열을 인식하여 점착성 말단(sticky ends)을 생성하기도 한다.

⑶ 제한 효소의 명명

제한효소의 명명은 그것을 생산하는 균주의 속명의 첫글자를 이탤릭체 대문자로, 종속명의 두 글자를 이탤릭체 소문자로 나타낸다. 예를 들면, HindⅢ의 경우, Haemophilus influenzae Rd로부터, KpnⅠ은 Klebsiella pneumoniae OK8로부터, SmaⅠ은 Serratia marcescens로부터 각각 분리한 것이다.