Agarose gel 전기영동
Ⅰ. 전기영동의 원리
전기영동(electrophoresis)은 전기장의 영향을 받아 하전된 물질들이 유동성 매체 내에서 이동하는 것을 말한다. 전하 또는 크기가 다른 분자들은 서로 다른 속도로 이동하며 이것이 전기영동 분리의 기본이 된다. 아가로즈(agarose)는 갈락토스(galactose)와 겔리듐 아만시(Gelidium amansii)의 한천(agar)으로부터 유도된 3,6-안하이드로칼락토스 단위체들 (anhydrogalactose units)로 구성되는 천연의 다당류이다. 겔은 전분 겔과 유사한 방법으로 끓는 물에 건조한 중합체를 넣고 상온에서 식힘으로써 얻어진다. 전분 겔보다 다공성 구조이며 적절한 강도를 가진다. 아가로즈 겔(agarose gel)에서의 전기영동은 보다 진정한 의미의 전기영동으로써 하전 된 분자들은 전기장의 영향에 의해 이동하나 지지 물질에 의해 저지되지 않는다. 아가로즈 겔을 이용한 전기영동은 가장 큰 거대 분자와 그 복합체인 바이러스 효소 복합체, 지질단 백질(lipoprotein), 핵산(nucleic acid)등의 전기영동에 이용되고 있다.
Ⅱ. 실험재료
Agarose gel(agarose, 0.5X TBE), DNA추출용액, 6X Gel loading buffer, Safe shineGreen Stain(EtBr-대체염색약), Staining Box, 전기영동장치, 전원공급장치, 0.5X TBE, (yellow) tip, 마이크로피펫, e-tube(1.5ml)
전기영동을 할 때 Gel 이 잠기는 buffer solution에는 여러 가지가 있으나 주로 TAB와 TBE가 사용된다. TAE는 주로 Agarose gel electrophoresis에 사용되고, TBE는 DNA sequencingdp 주로 사용된다. 그러나 큰 차이가 나는 것은 아니므로 교차로 사용되기도 한다. |
Ⅲ. 실험과정
1. Agarose gel 만들기
① Agarose 0.24g, 0.5X TBE buffer 30ml를 삼각플라스크에 넣는다. (0.8% Agarose gel) (5X TBE buffer 1L : Tris base 54g, Boric acid 27.5g, 0.5M EDTA(pH8.0) 20ml, 증류수)
② 전자렌지에 1～2분 정도 또는 알코올 램프로 가열하여 끓여 녹인다.
③ 젤 용액을 식힌 후 젤 제작 키트에 붓는다.
④ 젤이 굳은 후 전기영동에 사용한다.
Pre-made Agarose gel(1%, 0.5X TAE or TBE): 바로 DNA 전기영동을 할 수 있도록 미리 만들어 놓은 아가로스 겔로서 실험시간을 대폭 줄일 수 있습니다. |
2. 전기영동하기
① 전기영동 장치에 gel을 올려놓은 후에 0.5X TBE 용액을 부어 gel이 살짝 잠기게 한다.
② 준비된 DNA 용액 15㎕에 Gel loading buffer을 3㎕씩 넣고 섞어준다.
Gel loading buffer : 색깔을 나타내는 성분 외에도 glycerol 이 들어있어 DNA 용액을 무겁게 하여 agarose의 홈(well)으로 잘 가라앉히는 역할을 한다. 색깔을 나타내는 성분은 DNA와 같이 전기영동 되어 DNA의 흘러간 정도를 알 수 있게 한다. |
③ Gel의 well에 DNA+Loading buffer = 18 ㎕ 을 가만히 집어넣는다.
④ Well에서 먼 쪽이 (+)극이 되도록 전선을 전원 공급 장치에 연결시킨다.
⑤ 50～100V 정도에서 30분～1시간 정도 전기영동 시킨다. (loading 염색액이 gel에서 빠지지 않을 때까지 한다.)
⑥ 전기영동 된 gel을 Safe shine Green stain 용액(대략 증류수 100ml에 Stain 10㎕ 정도, 또는 임의로 염색액 양 조절 가능)에 10～30분 정도 담궈 염색한다.
⑦ 염색한 젤을 증류수에 넣어 탈색시킨 후 UV illuminator에 올려놓고 관찰한다.
Ⅳ. 참고자료
1. 전기 영동 장치 및 젤 제작 장치
2. 젤의 단면
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